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内容

HPLC与ICP-MS联用接口改进及重金属形态分析方法的应用开发。

HPLC与ICP-MS联用接口改进及重金属形态分析方法的应用开发。

一、项目意义

(一)拟进行功能开发的仪器设备现状描述(包括仪器设备工作原理、现状、主要应用领域、主要缺陷)

沈阳生态所目前拥有一个中国科学院污染生态与环境工程实验室,早在上世纪70年代就在国内率先开展了沈阳张士灌区土壤重金属污染调查及防治研究,而后相继开展了污水土地处理、土壤环境重金属元素背景调查、土壤-植物系统中有机、无机污染物的分布、迁移转化、生态毒理效应及生态修复等方面的研究,在污染生态学学科建设与发展方面做出了重要的贡献,为我国土壤-植物系统的污染防控对策提供了科学依据。目前我所以贾永峰研究员、谢凌天研究员、魏树和研究员等一批杰青人才领导的研究团队主要从事重金属Cd、As(半金属)的研究,随着研究工作的不断深入,通过承担"农田有机复合污染的控制与修复技术""辽东湾典型重金属污染物的环境归趋及生态效应"等863,973项目,其研究重点已从重金属全量转向有效态含量,从重金属迁移转化机制研究深入到重金属元素形态学分析,。以Cd为例,目前我所污染生态过程课题组研究证实,植物对Cd的富集能力与有机态Cd所占的比例具有密切关系,目前,Cd的主要存在形态包括游离态Cd、与蛋白结合的Cd、与植物螯合肽(PCs)结合的Cd、与小分子有机酸结合的Cd等,其中与PCs结合的Cd(简称Cd-PCs)在花生等豆科植物对Cd的富集能力和解毒机制方面发挥着关键作用。因此,定性、定量研究样品中特定元素的形态是确定其污染真实程度,全面评价其毒性,研究其迁移、转化规律的重要依据。

在上述研究中,所级中心现有的一台PE公司NexION 300X电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)发挥了重要的科研平台作用。它利用ICP电感线圈上施加的强大功率和高频射频信号在线圈内部形成高温等离子体,并通过气体的推动,保证了等离子体的平衡和持续电力,起到离子源的作用。MS是一个质量筛选和分析器,通过选择不同质荷比(m/z)的离子来检测到某个离子的强度,进而分析计算出某种元素的强度。ICP-MS技术,具有灵敏度高,能作多元素快速分析,检出限低,动态范围宽,分析精密度好,能作同位素比测定,识谱简便等优点,已逐渐发展为一种常规的元素含量分析测试技术。然而,随着科研工作的深入,我所科研人员已不在仅仅局限于重金属含量的测定,而是探求重金属在迁移、传递过程中形态的转化机制,而这一工作是单一ICP-MS作业无法完成的。因此,采用联用技术是解决这一分析难题的有效途径。大量联用技术研究表明, 高效液相色谱(HPLC)由于柱效高,分离速度快, 分离效果好与元素选择性好、灵敏度高的电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)联用,融合了HPLC的分离、定性和ICP-MS的定量分析等特点。可针对性地解决目前不同元素赋存形态分析的分离、定性和定量问题,是当前国际上ICP-MS分析技术中最活跃的研究内容。

但是,采用HPLC-ICP-MS联用技术作形态分析时,要解决的主要困难有:(1)HPLC系统的洗脱速度和ICP-MS的实时操作速度可能不匹配,降低了测定灵敏度;(2)由于有机溶剂的影响,分析物会在雾化器和雾室中产生记忆效应;(3)HPLC系统所用的洗脱溶剂会影响等离子体的稳定性或造成等离子体的局部冷却,甚至熄炬;HPLC系统的有机溶剂会造成碳的沉积,使锥孔堵塞。

目前,所级中心已经搭建了HPLC-ICP-MS联用平台,基本实现了系统的洗脱速度和ICP-MS的实时操作速度的相匹配,保证了测定灵敏度;并建立了雾化器和等离子体的清洗方法,新增了洗脱溶剂排出装置,保证了该系统对甲醇等少数几种有机溶剂的耐受性。目前急需要解决的问题是,改进联用接口进样装置,克服洗脱溶剂易影响等离子体的稳定性、造成等离子体局部冷却甚至熄炬的问题,彻底消除熄炬和锥孔堵塞,提高系统对乙腈等强极性有机溶剂的耐受性。

为此,本项目拟在现有研究仪器设备和研究基础上,通过对HPLC和ICP-MS联用接口的改进,优化仪器的整体性能,建立重金属元素形态分析平台,实现在线式镉、铅和砷等元素形态分析。本研究建立的重金属-金属有机配体结合形态分析方法,可以应用于我所开展的科研项目"污染土壤生态修复原理与方法"(973项目)、"环境中典型污染物生物的生态化学过程及修复原理"(国家自然科学基金重点项目)、"重点区域土壤风险评价与安全性区划/污染土壤修复与综合治理试点"(科技部重大专项)等多项课题的土壤植物中重金属形态学分析和污染修复机制机理研究,同时也可满足其它基金和科技支撑等项目测试需求。

(二)功能开发完成后能够解决的具体科研问题及其意义

通过本项目的实施,改进HPLC与ICP-MS的接口装置,提高联用装置的整体性能,与现有平台相比,将在灵敏度、稳定性、检出限方面大大优化,达到单一ICP-MS作业下的指标水平。尤其是可以允许流动相中乙腈、甲醇等有机溶剂的使用,且容许比例分别达到50%和100%,彻底改变了现有装置受流动相成分影响而限制其应用的局面,扩大了HPLC-ICP-MS的使用范围和应用领域。功能开发完成后的HPLC-ICP-MS联用系统可以实现环境、生物、食品等样品中不同形态金属元素的同时在线定量分析,提升我所的中国科学院污染生态与环境工程实验室平台功能,为我所Cd、As等重金属元素的形态学等研究提供技术手段,以更好的阐明重金属的赋存形态、迁移转化等行为特性,提升我所在重金属形态学研究领域的科研高度和成果水平。

(三)预期成果及应用领域

1、预期成果

利用生态所拥有的电感耦合等离子质谱仪(ICP-MS)仪器和高效液相色谱(HPLC),通过对ICP-MS进样接口的改进,以及金属形态分析方法的开发,在检测的灵敏度和降低有机溶剂的影响方面进行改进,实现与我所相关重金属镉、铅的植物螯合肽、尾矿砷形态的精确定量分析,建立相关的检测方法,为我所开展的环境和食品安全研究课题提供技术支撑。

2、应用领域

本研究建立的重金属-金属有机配体结合形态分析方法,可以应用于我所开展的科研项目 "辽东湾典型重金属污染物的环境归趋及生态效应""污染土壤生态修复原理与方法"(973项目)、"农田有机复合污染的控制与修复技术"(863) "环境中典型污染物生物的生态化学过程及修复原理"(国家自然科学基金重点项目)、"重点区域土壤风险评价与安全性区划/污染土壤修复与综合治理试点"(科技部重大专项)等多项课题的土壤植物中重金属形态学分析和污染修复机制机理研究,同时也可满足其它基金和科技支撑等项目测试需求。进而可为我所科研在快速和低成本的提高方面提供技术支持,可为我所农业和林业等学科的科研提供重要技术支撑,同时对提升我所支撑人员的技术水平,对提高我所科研装备自主创新能力均有具有积极的促进作用。

二、国内外仪器现状及发展趋势,项目完成前后仪器设备功能的技术指标对比

    1、国内外仪器现状及发展趋势

电感耦合等离子体质谱( ICP-MS) 凭借其多功能性和强的检测能力成为环境检测中痕量元素分析的主流仪器。ICP-MS具有灵敏度高、检出限低、选择性好测元素覆盖面广、线性范围宽、能进行多元素的同时检测同位素比测定等优点,是一种具有广阔前景的痕量(超痕量)无机多元素分析技术,广泛应用于环境、冶金、生物、医核材料分析等领域。目前,ICP-MS概念已不仅局限于早期的普通四极杆质谱仪,新型的质谱仪器发展迅速,仪器不升级换代,例如多接收器的高分辨磁扇形等离子体质谱(MCP-MS)、等离子体飞行时间质谱仪(ICP-TOF-MS),同时动态碰撞反应池等技术的引入,也使得ICP-MS器的分析性能大为改善。

由于元素在环境中的迁移转化规律及最终归宿,元素的毒性、有益作用及其在生物体内的代谢行为在相当大的程度上取决于该元素存在的化学形态,也在一定程度上与相关形态物质的溶解性和挥发性有关,因此元素形态分析在环境和生物分析中显得特别重要,并迅速成为环境和生物分析的研究重点。元素形态是指某一元素以特定的分子、电子和原子核结构存在的形式,包括同位素、不同价态、无机化合物、有机络合物、有机金属化合物、大分子络合物等。元素的生理活性和生物毒性与元素的形态密切相关,同一元素的不同形态对环境和人体健康具有不同的影响,甚至会有很大的差别。因此,元素毒性不仅与总量有关,还与元素存在的形态密切相关。As3+比As5+更容易与蛋白质中的巯基结合,所以毒性最大;适量的Cr3+是人体必需的微量元素,而Cr6+是有毒的,Cr3O72+是强致癌物质;甲基汞、四乙基铅、烷基砷等以有机态存在的重金属远比其无基态毒性强。因此,元素形态分析对ICP-MS提出了更好的技术要求。

由于传统的ICP-MS缺少的有效的分离手段,无法实现对不同形态的金属元素的同时、在线分析。而高效液相色谱(HPLC)具有柱效高、分离效果好、定性准确等优势,因而可以与ICP-MS联用,实现对不同形态金属元素的在线分离、定性和定量,是目前国际上发展的一种重要的联用技术。而且与其它分离手段相比,HPLC 与ICP-MS 联用技术的另一大优势在于接口技术相对简单,流速和压力匹配度高。ICP-MS和HPLC联用的接口通常是一根内径0.3mm的Teflon 管或PEEK 树脂管。

大量研究证实,HPLC-ICP-MS联用技术可以用于多种重金属元素的形态分析。例如,Ponthieu 等(2007)采用HPLC-ICP-MS联用技术从垃圾填埋场浸出液中分析出了6 种砷形态包括二甲基亚胂酸DMA、As( III)、一甲基亚胂酸MMA、As( V)、砷甜菜碱AsB 和氧化三甲胂( TMAO) 。Wolf 等(2007)在离子交换反相HPLC-ICP-MS 联用技术基础上,通过在流动相(2.0mmol/L 四丁基氢氧化铵5% 甲醛pH 7.6) 中添加了0.5mmol/L EDTA,使得Cr( III ) 和Cr(VI) 在2min之内即能实现快速分离检测,检出限分别为0.09ng/g和0.06 ng/g,该方法成功的被用于天然水、土壤渗出水和生物流体等实际样品中Cr的形态分析。Vacchina等(2009)用-SE-HPLC-ICP-MS-检测受Cd胁迫的植物组织的重金属-PCs。与PC2、PC3 和PC4 比较可知植物组织的细胞液和培养液中的Cd 与PC2、PC3 和PC4 生成了络合物。分析结果与RP -HPLC 柱后衍生物法相符。

一般来说,HPLC 的流动相通常含有无机盐或一定比例的有机溶剂( 如甲醇和乙腈等) ,当缓冲溶液的浓度高于0.1mol/L时,盐分会造成ICP-MS 的进样管采样锥和截取锥的堵塞,同时有机溶剂在雾化室内壁的粘附会造成分析信号的"记忆"效应,降低分析的灵敏度和稳定性,从而造成该联用技术分析元素形态时产生误差。因此,有机溶剂的大量使用会降低等离子体信号的稳定性,甚至造成信号消失,直接影响到最终的分析结果。例如使用冷却雾化室,或者在引入ICP 之前集成消解池,这些措施都可以减少有机溶剂进入等离子体。

2、项目完成前后仪器设备功能的技术指标对比

目前,我们已经建立了HPLC-ICP-MS联用平台,基本实现了系统的洗脱速度和ICP-MS的实时操作速度的相匹配,保证了测定灵敏度;并建立了雾化器和等离子体的清洗方法,新增了洗脱溶剂排出装置,保证了该系统对甲醇等几种含碳量低有机溶剂的耐受性,但在连续使用甲醇后,必须及时清洗管路,从而影响了仪器的运行效率。而且,目前该系统尚不允许使用乙腈等常见的、含碳量高的有机溶剂,从而大大限制了其应用。解决的办法是:改进联用接口进样装置,克服洗脱溶剂易影响等离子体的稳定性、造成等离子体局部冷却甚至熄炬的问题,彻底消除熄炬和锥孔堵塞,提高系统对乙腈等强极性有机溶剂的耐受性。

本项目拟在现有研究仪器设备和研究基础上,通过对HPLC和ICP-MS联用接口的改进,提高仪器的整体性能:

(1)流动相中有机溶剂的容许比例

改造前:甲醇,允许使用10%以下的甲醇溶剂,但不能连续进样多次,且需及时清洗;乙腈,不允许使用;

改造后:甲醇,允许使用,且容许比例达100%;乙腈,允许使用,比例可达50%。

(2)稳定性

改造前,随着多次进样,有机溶剂造成"记忆"效应,降低等离子体的稳定性,同一样品的测定结果波动大,甚至出现信号完全消失的现象,误差过大;

改造后,通过添加有机溶剂燃烧和冷却等装置,可大大减少导入等离子体的有机溶剂量,消除积碳的影响,从而延长工作时间,提高仪器运行效率,且同一样品连续进样的RSD≤5%,满足数据精密度和准确性要求。

(3)灵敏度

改造前,流动相中的有机溶剂会产生积碳现象,导致管路堵塞和熄炬,降低了等离子的稳定性和灵敏度,对含量低的成分完全检测不到等离子体信号;

改造后,通过加氧燃烧和低温冷却,实现了有机溶剂的预消除,消除了其对等离子体信号的干扰和抑制,大大提高信号响应值,将灵敏度维持在单一ICP-MS作业下的PPb水平。

(4)对样品中Cd-PCs的定量分析

改造前:由于现有Cd-PCs的分离必须使用乙腈,目前我们实验室已经通过方法优化将流动相中的乙腈比例降低到10%,但仍不能满足现有的HPLC-ICP-MS系统要求,因此,无法实现定量分析。

改造后:系统对乙腈的容许比例可达50%,因此可以实现样品中Cd、Cd-PC3、Cd-PC4等3种以上不同形态Cd的定量分析。

三、工作内容

(一)主要研究内容

研究目标:

利用生态所拥有的电感耦合等离子质谱仪(ICP-MS)仪器和高效液相色谱(HPLC),通过对ICP-MS进样接口的改近以及金属形态分析方法的改进,降低HPLC-ICP-MS联用过程中有机溶剂的影响,保持检测灵敏度基本不变。实现与我所相关重金属镉、铅的植物螯合肽、砷形态的精确定量分析,为我所开展的环境和食品安全研究课题提供技术支撑。

本项目主要有以下三部分研究内容:

(1)改进液相色谱与ICP-MS仪的联用接口进样装置。

在现有研究工作基础上,设计改进仪器联用进样接口,克服洗脱溶剂易影响等离子体的稳定性、造成等离子体局部冷却甚至熄炬的问题,减少有机溶剂造成的碳沉积、堵塞锥孔的困难,较好地克服记忆效应,实现良好的联用检测效果。

(2)系统的整体运行

  将多个改装部件组装形成接口装置,用于HPLC-ICP-MS 联用进样接口,并从HPLC和ICP-MS两部分优化测定条件,优化并确定系统的参数,提高分离和测试效果。

(3)分析方法建立。

依据课题研究的需求,开展系列植物螯合肽-镉络合物(Cd-PCs)分析方法的优化。选取Cd、Cd-PC3、Cd-PC4等三种不同形态的Cd,考察HPLC-ICP-MS对三种Cd的分离效果和定量结果,考察准确度、灵敏度和稳定性,建立基于HPLC-ICP-MS的重金属-金属有机配体络合物的分析方法。

(二)技术路线及设计图

(三)关键技术难点和解决思路

1、关键技术

 本项研究的关键技术主要包括三个方面:

(1)通过加氧燃烧减少有机溶剂产生的积碳

(2)通过低温冷却减少有机溶剂蒸汽对矩管等离子体的影响

(3)植物螯合肽-镉络合物的高灵敏检测实现

2、解决方案

(1)改进HPLC和ICP-MS的接口,设计增加向等离子体提供氧气供应管路,控制精确的氧气流,确保分解碳基质的同时不会出现炭黑沉积。并通过仪器提供的大型等离子观测窗口,控制氧气的流量。

(2)改进HPLC和ICP-MS的接口,设计低温雾化器冷却装置,实现将雾化器室的气溶胶温度冷却至-5℃以下,降低溶剂蒸气压力,从而提高等离子体的稳定性。

(3)在改进接口的前提下,通过采用"螯合肽-镉络合物标准品",结合HPLC的液相分析条件,对接口的温度,气体流量以及质谱采集条件进行优化,使得测试的灵敏度达到最佳,实现含有机溶剂流动相的HPLC和ICP-MS联用的分析。

(四)技术创新点

1、结合仪器的特点,设计进样接口,实现有机流动相的ICP-MS的应用,针对性和实用性强,可有效解决我所环境科研领域的迫切需求;

2、针对目前科研检测的实际需要,建立的植物螯合肽-镉络合物的方法对我所科研课题样品的测试提供了技术支持。

(五)项目的具体工作内容

1、防止炭黑沉积设计组装:针对流动相中有机溶剂碳含量高,而导致的产生未分解的碳(炭黑)并可能沉积在接口锥上,造成锥口堵塞和灵敏度迅速降低的问题。设计向等离子体提供氧气供应管路,控制精确的氧气流,确保分解碳基质的同时不会出现炭黑沉积。通过仪器提供的大型等离子观测窗口,控制氧气的流量。

2、冷却雾化室的设计组装:针对有机溶剂蒸气压力比水高,在高溶液流速下,常常导致等离子体难以维持和矩管熄灭的问题,设计采用半导体冷却装置,将雾化室的温度冷却至-5℃以下,降低溶剂蒸气压力,从而提高等离子体的稳定性。

3、改进后的仪器性能测试:连接设计改进的进样接口,采用含标准浓度金属离子有机溶液的对仪器性能进行测试,考察仪器的检测限,稳定性,稳定工作时间,并通过优化实验确定含有机溶剂样品的稳定仪器参数。

4、Cd-PCS络合物检测方法的建立:针对植物螯合肽的镉络合物(Cd-PCS),采用HPLC和ICP-MS联用技术,建立Cd-PCS高灵敏的分析方法,优化方法的分析条件,考察方法的准确性,稳定性,灵敏度等指标。满足重金属污染和植物富集等环境研究课题分析的需要。

四、技术基础(包括研究所现有的技术基础,以及国内外可供利用的技术资源等)

中国科学院沈阳应用生态研究所在开展林业、农业和环境生态基础性研究的同时,注重对大型仪器设备的依托,并从科研需求出发,积极开展现有仪器设备的功能开发和改造,新型仪器装置的研制,以及新方法和新技术的建立,取得了丰富技术成果,申请专利650余项,其中新仪器装置类专利80余项。

我所所级公共技术服务中心围绕国家生态、环境和食品安全重大战略需求,积极开展检测技术服务、检测技术研究、仪器功能开发研究,科研装备自主创新能力不断提高,中心技术人员的服务水平不断提升。中心在仪器研发方面具有丰富的经验,先后自助研发了流动注射分析仪、油酚测定仪、医用体液测定仪等12台仪器;研制了5台小型、便携式速测仪器及20余种配套试剂,并实现了商品化,可用于测定水体、土壤和植物样品中重金属等常见无机元素含量。多年来一直依托液相色谱和ICP-MS技术,建立了多种分析检测方法并在生态环境领域科研样品分析检测中得到应用。通过承担院仪器功能改造项目,提高了碳、氮稳定同位素比例质谱测定的稳定性和效率,为我所生态学领域的研究提供了新的技术支撑。

中科院沈阳生态所所级中心拥有原子吸收、原子荧光、气相色谱、液相色谱、液相色谱串级质谱、气相色谱串级质谱等仪器设备,能够满足本项目中比对和分析工作需求。需要改造的ICP-MS性能正常,仪器状态良好,完全可以满足本项研究的需要。

项目组现有人员22人,其中高级职称的8人,中级职称7人,博士2人,硕士以上学历的人员有10人,完全可以保证实验和项目研究的需要。

五、协作方式(与院内外和国际有关机构的协作内容)

六、实施进度

(一)项目目前已取得的实际进展

经过自然科学基金和863,、973专项计划初期工作和其它相关的项目实施,目前,所级中心已经完成了ICP-MS和HPLC联用,基本实现了系统的洗脱速度和ICP-MS的实时操作速度的相匹配, 保证了测定灵敏度;建立了雾化器和等离子体的清洗方法,新增了洗脱溶剂排出装置,保证了该系统对甲醇等少数几种有机溶剂的耐受性。建立了不同形态汞的测定方法并在科研中得到了应用。可以实现元素的无机形态分析和部分有机结合态分析。

(二)项目实施进度计划安排(以月为单位)

2014年1月-6月,HPLC-ICP-MS联用平台的改进和系统性能考察。

2014年7月-9月,以重金属Cd为例,开展Cd-PCs结合态的在线分析,初步建立分析方法

2014年10月-11月,以实际植物样品为例,考察实际样品分析的方法学指标

2014年12月,形成仪器的应用实验报告,应用测试,组织验收。

(三)项目实施年度目标

2014年度,完成HPLC-ICP-MS联用系统的进一步优化和方法初探。建立实际样品中Cd-PCs结合态分析,方法优化并达到应用水平。

七、验收技术指标

     通过改进ICP-MS仪器的进样接口,实现HPLC-ICP-MS联用的流动相中有机相的应用,并建立一种重金属形态分析方法。

序号

技术指标名称

功能开发后预计达到的参数

1

流动相中有机相比例

甲醇可达到100%;乙腈大于50%

2

稳定性

连续进样6次,RSD≤5%

3

灵敏度

10小时内维持PPb级

4

样品中Cd-PCs的定量分析

同时分析3-5种Cd-PCs(含无机Cd)

 

八、项目组

(一)项目成员(10人以内)

姓名

年龄

职称

专业

工作单位

项目中承担的

主要任务

王颜红

50

研究员

应用化学

沈阳应用生态研究所

方案设计、进度协调

崔杰华

43

高工

应用化学

沈阳应用生态研究所

进样接口设计

李国琛

29

助研

环境科学

沈阳应用生态研究所

分析方法建立

张  红

34

高级工程师

分析化学

沈阳应用生态研究所

分析方法建立

简峰

29

助工

仪器仪表

沈阳应用生态研究所

参数优化

王念虎

24

研究生

环境科学

沈阳应用生态研究所

方法优化

 

 

(二)项目负责人简介(不超过200字)

王颜红,研究员,所级中心常务副主任。长期致力于实验室大型仪器装备的应用、功能开发,面向我所学科需求主要从事新方法和新技术研究,在环境生态系统中的铅,镉,汞、砷等元素分析方面经验丰富,建立了多项元素及硒形态分析的方法,处于国内先进水平。主持完成了国家、院、省市课题30余项。近5年来发表学术论文40余篇,其中SCI12篇,申请专利8项,编制标准13项,参与出版专著2部。